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    應用HaloTag pull-down技術鑒定了與胡楊CPK21互作的重金屬脅迫相關蛋白

    更新時間:2024-01-29   點擊次數:197次

    鎘(Cd)污染因其毒性在全球范圍內造成了嚴重的生態問題,重金屬對植物造成的傷害除了離子毒害效應,還會影響植物的水分狀況,造成植物生理干旱。當前,干旱也已成為全球農林業生產和發展的重大威脅。

    胡楊(Populus euphratica)是廣泛分布于我國西北干旱、鹽堿地區的一種高大喬木,具有很強的抗旱耐鹽能力,并且能夠吸收和積累重金屬,是研究樹木抗逆生理和分子機制的重要模式樹種。

    鈣(Ca2+)是植物感知生物和非生物脅迫的典型信號分子,Ca2+信號和cpk對廣泛的環境刺激做出反應,并協調信號網絡和生理反應(Poovaiah等,2013)。然而,Ca2+信號和cpk是否調節植物對重金屬的反應很少被研究。

    2023年12月19日,北京林業大學陳少良教授課題組研究成果,發表在Plant Stress期刊上(影響因子5.0),文章題目為Populus euphratica CPK21 interacts with heavy metal stress-associated proteins to mediate Cd tolerance in Arabidopsis。


    該研究借助HaloTag pull-down技術,富集了PeCPK21相互作用蛋白,Cd處理后相應的表達譜表明,PeCPK21與重金屬脅迫相關蛋白(HMAPs)相互作用,介導了轉基因擬南芥對Cd的耐受性。


    1.Cd處理的胡楊中的PeCPK21表達

    PeCPK21的表達在根和葉中不同。葉片中,PeCPK21轉錄物在CdCl2處理3小時后增加,6小時達到峰值,隨后迅速下降,12h后進一步增加。根系中,Cd處理12 h后PeCPK21顯著增加,24h達到峰值,而后迅速下降。


    2.Cd激活擬南芥PeCPK21啟動子表達

    胡楊PeCPK21啟動子構建PeCPK21pro轉到擬南芥中。無CdCl2脅迫,根、子葉和下胚軸中GUS信號濃度較低。CdCl2脅迫,根,子葉和下胚軸中的GUS活性增加。結果表明Cd激活PeCPK21,PeCPK21在胡楊根葉表達增加。

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    3.PeCPK21轉基因擬南芥的Cd耐受性

    作者選擇8個PeCPK21轉基因擬南芥品系,確定其在鎘脅迫下的作用。RT-qPCR表明,在轉基因系中表達高,OE2中表達高,OE8低。之后選OE3、OE7和OE10轉基因幼苗進行鎘實驗。CdCl2處理WT、VC和三個轉基因系確定鎘耐受性的表型差異,結果表明,在CdCl2脅迫下,PeCPK21正調控轉基因擬南芥根長、鮮重和膜穩定性。

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    4.根系中細胞鎘的積累和鎘通量

    Cd熒光探針檢測根部細胞Cd含量。用CdCl2處理后,所有根細胞熒光顯著增加,轉基因擬南芥熒光強度相對較低,對照組幾乎無熒光,這表明PeCPK21抑制Cd在擬南芥根積累。NMT監測擬南芥幼苗根尖中Cd通量,對照組中根頂端區域通量低,幼苗中Cd通量高,而轉基因系OE3、OE7和OE10的Cd2+通量顯著降低。


    5.H2O2積累和抗氧化酶活性

    Cd積累促進植物細胞產生ROS。用熒光探針H2DCF-DA測定根部細胞H2O2濃度。CdCl2處理后,所有擬南芥熒光強度均顯著增加,轉基因系中Cd誘導的H2O2增加降低,對照組DCF熒光非常低。檢測CAT、APX、POD和SOD的總活性,確定PeCPK21過表達植株在鎘脅迫下不產生ROS。CdCl2脅迫下所有品系的APX、POD和CAT活性增加,OE3、OE7和OE10活性最高。但CdCl2抑制SOD的活性,WT、VC和PeCPK21過表達的品系中沒有顯著差異。


    6.擬南芥中PeCPK21相互作用的蛋白

    為探究PeCPK21介導Cd和ROS穩態的功能,用HaloTag pull-down技術富集與PeCPK21相互作用蛋白。該實驗過程是使用體外真核蛋白表達系統將PeCPK21表達出來,再與胡楊的總蛋白進行Pull down實驗,最后將與PeCPK21結合的蛋白進行質譜鑒定。

    與PeCPK21相互作用的HaloTag pull-down富集蛋白列中,分為四組:

    (I)陽離子/重金屬轉運蛋白、膜聯蛋白、K+–H+交換樣蛋白(KHEP)、鈣單向轉運蛋白、銅轉運蛋白5(COPT5)、寡肽轉運蛋白3(OPT3)、植物防御素樣蛋白2.2(PDF2.2)、PM相關陽離子結合蛋白(PCAP1)和ABC轉運蛋白I家族成員6(ABCI6);

    (II)質子泵亞基、V型質子ATP酶亞基a3(VHAa3)、VHA-B1、VHA-C、焦磷酸鹽活化膜質子泵2(AVPL1)和V型質子ATP酶蛋白脂質亞基(AVA-P2);

    (III)抗氧化酶,類囊體抗壞血酸過氧化物酶(TAPX),超氧化物歧化酶(MSD1),抗壞血酸過氧化物酶1(APX1),APX2,APX3,硫氧還蛋白M4(TRXM4),9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED1),GPX3,硫氧還蛋白樣蛋白CDSP32和硫氧還蛋白超家族蛋白(PRXQ);

    (IV)膜內源蛋白、質膜內源蛋白1;1(PIP1-1)、PIP2-6、PIP2-7、PIP2A和tonoplast內源蛋白。

    7.PeCPK21相互作用蛋白的轉錄本分析

    7.1陽離子/重金屬轉運蛋白的轉錄

    通過鈣滲透通道介導Cd進入的膜聯蛋白的轉錄被CdCl2上調,在PeCPK21-OE3、7、10中低于WT和VC。CdCl2增加擬南芥中鈣單向轉運體、KHEP、COPT5、OPT3和PDF2.2的表達,但在PeCPK21過表達系中觀察到更高的水平。然而,用CdCl2處理所有樣品中PCAP1和ABCI6的轉錄并未顯著改變。


    7.2質子泵亞基的轉錄

    CdCl2處理增加了所有測試品系中VHA-B1、VHA-C、AVPL1和AVA-P2的表達。與WT和VC相比,VHAB1、VHA-C和AVA-P2的Cd誘導在PeCPK21過表達的品系中更為明顯。然而,在所有測試品系中,VHA-a3的轉錄均未改變。

    7.3抗氧化酶的轉錄

    所有測試品系證明CdCl2上調PeCPK21相互作用的幾種抗氧化酶的表達。與WT和VC相比,這些抗氧化酶TAPX、APX1、APX2、TRXM4、NCED1、GPX3、CDSP32、PRXQ在PeCPK21-OE3、7、10中表達量高。


    7.4膜內源蛋白的轉錄

    CdCl2脅迫后,PIP1-1、PIP2A和PIP2-7的轉錄水平增加,與WT和VC相比,PeCPK21過表達植物的水平更高。CdCl2處理不影響PIP2-6和TIP1的轉錄。

    小結:

    綜上所述,Cd通過激活PeCPK21啟動子上調胡楊PeCPK21的轉錄。鈣傳感器PeCPK21可以提高植物對Cd脅迫的耐受能力,表現為過表達PeCPK21的擬南芥的根和全株生長減少較少。HaloTag pull-down富集蛋白和相應的表達譜表明,PeCPK21通過與多種重金屬脅迫相關蛋白相互作用,限制Cd積累,增加ROS清除,改善轉基因擬南芥的水分狀況,從而提高Cd耐受性。


    HaloTag Pull down技術簡介

    體外蛋白表達與Pull down技術相結合,表達出目的蛋白和標簽蛋白(Halo,GST,His等)的融合蛋白,不受抗體和物種限制,僅借助標簽的親和介質將目標蛋白純化出來,使用Pull down技術,將目標蛋白與互作的蛋白“下拉",進而利用Western Blot或者質譜鑒定互作蛋白。蛋白Pull down實驗還可以同時表達兩個蛋白,進行點對點的互作驗證,也可以僅表達蛋白質的結合區域,確定兩個蛋白結合的結構域。

    本公司能夠提供Halo,GST或FLAG等多種標簽的Pull down技術服務。

    Halo/FLAG-tag pull down是使用基于真核的體外表達系統來表達目的蛋白,目的蛋白攜帶Halo/FLAG標簽;GST-tag pull down是使用基于原核的體外蛋白表達系統,或者大腸桿菌誘導表達目的蛋白,目的蛋白攜帶GST或His標簽。

    Halo/FLAG-tag pull down技術優勢:

    真核表達系統,蛋白更接近體內結構

    沒有細胞內干擾因素的限制,表達成功率高

    蛋白表達載體構建成功后,不需要轉化和鑒定,可直接表達目的蛋白,節省時間

    步驟

    內容

    交付內容

    周期

    載體構建

        ·       客戶提供目的蛋白對應的CDS的序列或質粒

        ·       克隆至合適的表達載體

        ·       質粒測序

        ·       質粒制備

    測序結果

    1-2周

    無細胞表達+純化

        ·       用小麥芽胚蛋白表達體系進行蛋白表達

         ·       蛋白表達評估 (Western Blot)

    表達評估結果

    1周

    Pull Down

        ·       細胞裂解

        ·       目的蛋白和總蛋白孵育

        ·       洗脫與目的蛋白結合的蛋白

    銀染結果

    1周

    質譜檢測

        ·       將洗脫的蛋白進行質譜鑒定

    質譜結果

    2-3周

    生信分析

        ·       對質譜鑒定到的基因進行GO和KEGG的富集分析

    生信分析結果

    1周






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