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    ChIP-seq染色質免疫共沉淀測序

    更新時間:2024-03-19

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    廠商性質:生產廠家

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    簡要描述:
    ChIP-seq染色質免疫共沉淀測序研究體內蛋白質與DNA相互作用
    體內高效檢測重組蛋白、轉錄因子在基因組的結合位點。
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     ChIP-seq染色質免疫共沉淀測序

    ChIP-seq染色質免疫共沉淀測序常見問題

    1. Input和IP樣本之間的關系是什么?
    Input和IP屬于兩個樣本,在前期檢測、建庫、測序都是平行進行的,但是分析中需要將兩個樣本的測序數據進行整合分析,得出終的peak結果,并進行后續分析。

    2. Input是什么?有什么作用?
    我們將DNA或者RNA fragmentation后,在進行免疫沉淀前,需要取一部分斷裂后的染色質做Input對照(不進行免疫沉淀過程)。Input是斷裂后的基因組DNA或者RNA,需要與沉淀后的樣品DNA/RNA一起經過逆轉交聯,DNA/RNA純化,以及后的PCR或其他方法檢測。通過后續數據分析,我們可以通過Input對照排除背景噪音(排除因本底表達水平高或一些非特異性結合所造成的假陽性peaks),驗證染色質斷裂的效果和整個實驗中IP效果,所以Input對照是IP-seq實驗*的步驟。

    3. 陽性對照和陰性對照是什么?
    陽性對照

    一般用anti-RNA polymerase II抗體,因為RNA polymerase II是通用轉錄因子,在所有細胞中都能結合基因的核心啟動子區,因此理論上,ChIP后PCR會有條帶。一般陽性對照不進行測序。

    陰性對照

    陰性對照分為mock和Input兩種,二者均能起到減少假陽性的作用。mock:用普通IgG為抗體,理論上不會ChIP下來任何DNA fragment,因此作為陰性對照,但是由于非特異性結合,或者實驗過程,沒發生結合的DNA清楚不*,可能會出現條帶,但是一般條帶亮度較弱。IgG不需要進行測序,只是判斷IP試驗中所選取的抗體是否特異。

     

    4. ChIP-seq的推薦測序數據量是多少?是否需要設置重復?

    一般來說,ChIP得到的DNA fragment豐富度較低,大數據量測序意義不大。按照ENCODE目前標準:轉錄因子建議有20 M以上的可用reads;不同組蛋白標準不一,基本在20 M-45 M可用reads。

    ChIP-seq的實驗過程較為復雜,早期文章中往往缺少重復樣本的設置。不過為了提高文章結論的可信度,目前的分析標準中通常推薦有2個以上的生物學重復;對于樣本較難獲得的情況,可以不設置生物學重復。

     

    5. ChIP實驗中使用的對照樣本是否也需要測序?需要哪些對照?

    ChIP富集中常見的對照包括:

    1)input,片段化后未經抗體富集的染色質后期去蛋白得到的DNA;

    2)陽性對照,利用普通組蛋白或RNA聚合酶等陽性蛋白抗體進行免疫沉淀得到的DNA;

    3)陰性對照,免疫沉淀過程中不加入抗體或者加入非特異性IgG抗體得到的DNA。

    其中,input在數據分析時用于除去背景、進行檢峰,是必須要進行建庫測序的樣本;陽性對照所用抗體與目標蛋白無關,不必進行建庫測序;陰性對照理論上基本不會捕獲到足量DNA,無法進行建庫測序。

     

    相關技術服務:

    1、 DNA親和純化測序(DAP-seq):高通量檢測轉錄因子或DAN結合蛋白在基因組上的結合位點。

    2、 酵母單雜交:DAP-seq后續驗證服務。

    3、 EMSA:驗證蛋白和DNA是否結合,可用于DAP-seq的后續驗證。

    4、 DAP-seq與RNA-seq聯合分析: 分析轉錄因子的靶基因在RNA-seq數據中的表達變化,深入挖掘DAP-seq和RNA-seq測序數據,增加轉錄組測序的分析深度。

    5、 DNA-pull down:鑒定與DNA結合的蛋白。

    6、 精美的論文圖片設計與制作:專業設計師,設計精美論文插圖,提升論文的嚴謹性和美觀度。

     

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